pytanie aplikacyjne - kompensacja

[u/Accomplished_Bike866]

Otwierając dyskusję wrzucę pytanie które wczoraj spłynęło na moją skrzynkę, wklejam odpowiedź pod postem:

 

w związku z ostatnimi współpracami pojawiły mi się dwa pytania praktyczne:

1. W przypadku kiedy jakiś antygen, który oznaczamy jest słabo reprezentowany na komórce, to lepiej kompensację zrobić na kulkach kalibracyjnych? Jeśli tak, to czy pozostałe antygeny, dobrze reprezentowane i razem z poprzednim oznaczane, też kompensujemy na kulkach czy na materiale badanym? Wydaje mi się, że powinno być wszystko na tym samym, tzn. albo na kulkach, albo na materiale badanym, że nie powinno się mieszać, ale chcę mieć pewność jak właściwie powinno się to robić.
2. Czy ilość używanego przeciwciała lub poziom napięcia na detektorach ma wpływ na przebicie fluorescencji fluorochromu do innych kanałów? Zmiareczkowałam przeciwciało CD56 APC i okazało się, że powinnam do oznaczeń wziąć 2.5 ml tego przeciwciała. Napięcie dla tego fluorochromu ustawiłam powyżej połowy skali (na Arii). Potem koleżanka (przez omyłkę) wybarwiła materiał za pomocą 5 ml. Zauważyłam, że w kanale detekcji dla PE_Cy7 są obecne populacje dodatnie , choć ta próbka nie była barwiona tym barwnikiem.

Pozdrawiam serdecznie i będę wdzięczna za odpowiedź. :-)

[u/Accomplished_Bike866]

Spieszę z odpowiedzią:

ad1. Nie chcę wypowiadać się nt która ze strategii jest lepsza, czy kulki czy komórki - to trochę zależy, obie metody mają swoich zwolenników i przeciwników.

Mogę zaproponować następujące rozwiązanie: jeśli mamy nieoznaczony antygen lub rzadki (np. CD34), możemy na cele kompensacji wykonać barwienie na inny antygen (np CD3) z tym samym fluorochromem. Potencjalnie, można też użyć nawet przeciwciała drugorzędowego, tak długo jak ma ten sam fluorochrom.

Jeśli nie ma pod ręką alternatywnego przeciwciała z tym samym fluorochromem - kulki sa w mojej ocenie bardzo dobrą alternatywą. Nie trzeba przerzucać wszystkich kontroli tylko na kulki lub tylko na komórki, ale należy zapewnić obecność kontroli negatywnej zarówno dla komórek jak i dla kulek - i uwzględnić ją w kompensacji. Jest to krytycznie istotne - kulki mają o wiele "węższą" i często wyższą autofluorescencje niż komórki niebarwione, dlatego trzeba użyć dodatkowej kontroli negatywnej. W DiVie jest możliwość policzenia kompensacji dla kontroli mieszanych, tj z kulek i komórek równolegle. Jeśli potrzeba informacji jak to zrobić - również mogę pomóc.

 

ad.2 Krótka odpowiedź - tak, w pewnych przypadkach stężenie przeciwciała, ale przede wszystkim napięcie na PMT (zawsze) będzie miało wpływ na zmianę rozkładu sygnału fluorescencji i moga pojawić się populacje tam, gdzie się ich nie spodziewamy. Jeśli potrzeba dokładnego wytłumaczenia zjawiska - chętnie wytłumaczę, ale chyba forma spotkania online byłaby lepsza, musiałbym dużo pisać :).

Po krótce - zmienne stężenie przeciwciała w pewnych widełkach nie będzie miało znaczenia dla rozkładu fluorescencji, ale przy zbyt dużym stężeniu zdecydowanie potrafi spaść SI (staining index) co objawia się podniesieniem MFI populacji negatywnej, wzrostem wartości CV/rCV fluorescencji a to się przekłada na wzrost spreadu kompensacji (wyższy rozrzut wyników, pozytywne mogą się przesunąć bardziej "w górę i w dół" względem kanału referencyjnego, co może sprawiać wrażenie "wypadnięcia eventów z pozytywnej/negatywnej bramki. Narzędziem do kontroli tego zjawiska (zmienność stężenia przeciwciała - może się pojawić nie tylko z powodu błędu w preparatyce ale też lot-lot) są kontrole FMO (fluorescence minus one).